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Accueil du site > Équipes > Équipe 2 Ingénierie Moléculaire, Cellulaire, Thérapeutique et GlycosylTransférases

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Thématiques : 

L’équipe MolCelTEG explore la machinerie de biosynthèse et les mécanismes physiopathologiques d’assemblage des glycosaminoglycanes et des collagènes, principales macromolécules du micro- et macro-environnement cellulaire.

- Nous étudions la structure, les fonctions et les régulations des enzymes responsables de la biosynthèse et de la maturation des glycosaminoglycanes  (glycosyltransférases/ sulfotransférases) et du collagène (lysyloxidase).

- Nous cherchons à établir les mécanismes de dysfonctionnement de ces enzymes conduisant à des désordres d’assemblage des matrices extracellulaires lors de situations pathologiques (pathologies ostéo-articulaires, maladies génétiques rares, cancer, fibrose)

- Notre but ultime est de corriger ces dysfonctionnements pathologiques par des approches thérapeutiques et de bio-ingénierie ciblant ces enzymes (xylosides, GAG-based drugs, anticorps, composés naturels).

Nos recherches s’appuient sur une approche multi-échelle de la molécule au patient.

Notre ambition est de parvenir à des solutions thérapeutiques concrètes dans les maladies impliquant des désordres de la synthèse des glycosaminoglycanes et/ou du collagène.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Axes stratégiques de l’équipe MolCelTEG

Contexte scientifique :

Le début du 21ème siècle est marqué par l’émergence des glycosciences, et leurs applications dans de multiples domaines, notamment en santé. L’année 2016 a fêté les 100 ans de la découverte de l’héparine, chef de fil de la famille des glycosaminoglyanes, dont le succès commercial et industriel ne se dément pas depuis 1935, date des premiers essais cliniques.

Les recherches de l’équipe MoLCelTEG explorent spécifiquement cette classe majeure de molécules glucidiques que sont les glycosaminoglycanes.

Les glycosaminoglycanes sont les chaines polysaccharidiques linéaires fixées sur le squelette protéique des protéoglycanes. Associées au réseau collagénique, elles sont particulièrement abondantes dans les matrices extracellulaires des tissus conjonctifs (cartilage, peau, os, paroi des vaisseaux…). Elles sont également présentes de façon ubiquitaire au niveau de la membrane plasmique des cellules des organismes vivants, occupant ainsi une position stratégique à l’interface cellule-matrice,

Les glycosaminoglycanes exercent deux fonctions biologiques fondamentales : (1) Ils transduisent les signaux de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule et sont les acteurs-clés de la communication intercellulaire ; (2) Ils organisent, avec les collagènes, l’architecture des matrices extracellulaires et sont responsables des propriétés biomécaniques des tissus. Ces fonctions dépendent d’interactions multiples avec de petits ligands comme les facteurs de croissance ou d’adhésion et avec des macromolécules comme les collagènes. Cette capacité d’interaction exceptionnelle les conduit à jouer un rôle majeur dans une variété étonnante de processus biologiques comme la prolifération, la migration, la différenciation cellulaires, la morphogenèse des tissus et le développement embryonnaire, les cascades de coagulation, le métabolisme lipidique, la thrombose, le développement cérébral.

 

Les glycosaminoglycanes sont attachés de façon covalente à des sites [Ser-Gly] spécifiques de la protéine core des protéoglycanes (à l’exception de l’acide hyaluronique). Après synthèse de la protéine core dans le réticulum endoplasmique, la fabrication des glycosaminoglycanes s’effectue essentiellement dans les différents compartiments de l’appareil de Golgi au cours du trafic du protéoglycane vers la membrane plasmique ou la matrice extracellulaire. Ce processus est finement régulé de manière à permettre l’obtention d’une structure glycosaminoglycanique exacte capable de médier une fonction biologique donnée.

La biosynthèse des glycosaminoglycanes est initiée par la formation d’une amorce tétrasaccharidique (acide glucuronique-β1,3-galactose-β1,3-galactose-β1,4-xylose-β1-O-) commune aux deux principaux types de glycosaminoglycanes i.e. les héparane-sulfates (HS)/héparine (Hep) et les chondroitine-sulfates, (CS)/dermatane-sulfates(DS). L’élongation de la chaine s’effectue par formation d’un motif dissacharidique composé d’un sucre aminé et d’un acide uronique. Le transfert des éléments constituant ce motif élémentaire se fait de façon successive et coordonnée. Il est catalysé par des glycosyltransférases de la famille des HS-synthases (EXTL1/2/3 et EXT1/EXT2) pour l’Hep et des HS et par des CS-synthases (CSS) pour les CS/DS. Les chaînes de glycosaminoglycanes subissent simultanément de nombreuses modifications comprenant principalement des O- et N-sulfatations (réalisées par des sulfotransférases spécifiques) et une épimérisation de l’acide glucuronique en acide iduronique (par la C5-épimérase).

La biosynthèse des glycosaminoglycanes

La synthèse de la chaîne de GAG est initiée par la formation d’une amorce tétrasaccharidique (GlcA-β1,3-Gal-β1,3-Gal-β1,4-Xyl-β1-O-) fixée sur certains résidus Ser-Gly. Elle débute par l’addition d’un xylose (Xyl) par les xylosyltransférases I et II (XylT-I/II), suivie par l’ajout de deux résidus galactose (Gal) par les galactosyltransférases I (β4GalT7) et II (β3GalT6) respectivement et d’un acide glucuronique (GlcA) par la glucuronosyltransférase I (GlcAT-I). Les motifs disaccharidiques composés d’une N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) pour les HS et l’Hep ou une N-acétyl-D-galactosamine (GalNAc) pour les CS/DS et d’un acide uronique, l’acide D-glucuronique (GlcA) ou l’acide L-iduronique (IdoA) sont ensuite ajoutés pour former les Hep/HS (par l’intermédiaire des HS-synthases) ou CS/DS (par l’intermédiaire des CS-synthases) respectivement. Les chaînes de GAGs subissent ensuite en cours de synthèse, de nombreuses modifications comprenant une phosphorylation et de multiples O- et N-sulfatations (d’après Breton, Fournel-Gigleux et al. 2012 LIEN revue).

 

Des désordres de la fabrication des glycosaminoglycanes sont impliqués dans un large éventail de maladies incluant les pathologies ostéo-articulaires (arthrose), les maladies génétiques rares  dans lesquelles les enzymes de biosynthèse des glycosaminoglycanes sont mutées et la maturation du collagène altérée (syndrome d’Ehlers-Danlos), les maladies neurodégénératives (Alzheimer), les pathologies cardiovasculaires (athérosclérose) et de nombreux types de cancers (cancers du sein, poumons, foie, chondrosarcome…).

Objectifs :

L’étude des enzymes de biosynthèse (glycosyltransférases et sulfotransférases) au sein de l’équipe MolCelTEG a pour objectif d’établir les relations entre un défaut de production, ou une production anormale de glycosaminoglycanes et les altérations tissulaires et cellulaires observées dans un contexte clinique.

Les informations obtenues sont utilisées pour mettre en place des stratégies thérapeutiques permettant de s’opposer à l’altération des glycosaminoglycanes dans un contexte pathologique en développant des approches thérapeutiques et de bio-ingénierie ciblant les glycosyltransférases.

Ces travaux s’inscrivent principalement dans le domaine des maladies ostéo-articulaires (arthrose), des maladies génétiques rares (syndrome d’Ehlers-Danlos), ou encore des cancers (cancer du sein, chondrosarcome).

Ils font appel à des approches pluridisciplinaires à l’interface biologie-biochimie-biophysique-chimie.

 

Les travaux de l’équipe sont organisés selon deux axes :

Axe 1 (animé par Sylvie Fournel-Gigleux) :

Principaux projets :

- Étude structurale et fonctionnelle des glycosyltransférases impliquées dans les étapes précoces de la biosynthèse des glycosaminoglycanes (β1,4-galactosyltransférase 7 (β4GalT7)  et β1,3-galactosyltransférase 6, (β3GalT6)).

=> Approches de biologie moléculaire, biochimie et biophysiques.

- Recherche et développement de molécules glycosidiques bioactives ciblant ces enzymes et permettant de moduler (activer ou inhiber) la biosynthèse des glycosaminoglycanes (in vitro, in cellulo et in vivo) à visée thérapeutique.

=> Approches « structure-based » et criblages de banques, réel et virtuel. Développement de nouvelles méthodes de criblage des interactions protéine-sucre par fluorescence.

- Décryptage des mécanismes moléculaires des désordres de l’assemblage de la matrice extracellulaire dans différentes situations pathologiques :

  • Conséquences des mutations des β4GalT7 et β3GalT6 sur la pathogénie de maladies génétiques rares des tissus conjonctifs (syndromes d’Ehlers-Danlos). Rôle des glycosaminoglycanes dans la maturation normale et pathologique du collagène (Plateforme de protéomique).
  • Mécanisme séquentiel de maturation post-traductionnelle, notamment à l’origine des cross-links et des clivages protéolytiques régissant la dynamique d’assemblage du collagène et les propriétés mécaniques résultantes.         
  • Conséquences et mécanismes oncogènes de la 3-OST3A (HS3ST3A) dans le cancer du sein.

=> Approches cellulaires, moléculaires, modèles animaux, études cliniques

 

Axe 2 (animé par Mohamed OUZZINE) :

Principaux projets :

- Établissement d’un modèle animal (souris KO) déficient en xylosyltransférase I et sa caractérisation en termes de développement et de manifestations pathologiques chez l’embryon.

- Compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine des anomalies de développement observées chez l’embryon de souris déficientes, en particulier au niveau du système musculo squelettique.

- Génération d’un modèle de KO conditionnel chez la souris pour permettre l’inactivation contrôlée du gène XylTI (dans la mesure où l’inactivation du gène XylTI est létale).

- Étude du polymorphisme du gène XylTI pour expliquer si une mutation de ce gène peut être un facteur de risque quant à l’apparition de pathologies liées à un défaut de synthèse des protéoglycanes (arthrose).

- Développement de stratégie de bio ingénierie visant à s’opposer au défaut de production des glycosaminoglycanes en recherchant des molécules capables de stimuler l’activité de la xylosyltransférase I.

=> Approches pluridisciplinaires mettant en œuvre la production, la purification et la caractérisation structurale et fonctionnelle des glycosyltransférases recombinantes, l’établissement de modèles cellulaires et animaux ciblant ces enzymes ou encore la recherche de molécules bioactives spécifiquement dirigées contre ces potentielles cibles pharmacologiques.

Faits marquants sélectionnés

1. Découverte de nouvelles situations pathologiques sévères dans lesquelles un défaut de synthèse ou de maturation des GAG joue un rôle primordial : 

- Nous avons montré que la sulfotransférase 3-OST3A (HS3ST3A) est oncogène dans une forme agressive de cancer du sein (HER2+). Nous avons ainsi établi la 3-OST3A comme marqueur pronostique de la malignité des tumeurs dans ce sous-type de cancer du sein (Mao/Gauche et al. 2016, Oncogene)

- Nous avons découvert qu’une maladie génétique rare (syndrome d’Ehlers-Danlos) est due à des mutations de la glycosyltransférase β3GalT6 (Malfait et al. 2013, Am. J. Hum. Genet).

La 3-OST3A exerce des effets pro- ou anti-oncogéniques en fonction du contexte cellulaire. Dans les cellules MCF-7, la 3-OST3A est épigénétiquement réprimée et joue un rôle suppresseur de tumeur par un mécanisme et des voies de signalisation dépendants du FGF7 et du FRGR2IIIB. Dans les cellules HER2+ et chez les patientes atteintes de cancer du sein de ce sous-type la 3-OST3A exerce une activité oncogénique. Chez ces patientes, ce gène représente un marqueur pronostic de malignité du cancer du sein (Mao/Gauche et al. 2016, Oncogene).

 

 

2. Développement de ligands de la b4GalT7 par une approche rationnelle basée sur la structure de cette enzyme (Saliba et al. 2015, J. Biol. Chem.). Mise au point d’une technique originale de criblage des interactions protréine-sucre par méthode de fluorescence qui a fait l’objet d’un brevet.

 

Principe de la technologie Glyco-Fluo (Patent WO2016/038205). La molécule de sucre (symbole bleu) est couplée au N-MANT (N-methylanthranilate, cercle vert). Au sein du site actif hydrophobe de la protéine d’intérêt (cercle plein orange), le signal du N-MANT augmente (cercle jaune). Lorsque le dérivé sucre-MANT est déplacé par un compétiteur (croix noire) présent dans une chimiothèque, le signal de fluorescence de la molécule diminue. Les techniques de FRET et d’anisotropie de fluorescence peuvent alternativement être employées et portées à haut débit pour le criblage de banques. Ce procédé a été adapté à l’étude des interactions Maltose Binding Protein-maltose-MANT et β4GalT7-Xylose-MANT.

3. Le propeptide C-terminal du procollagène de type II, également appelé Chondrocalcin, est un déterminant critique de la maturation du collagène, mais est clivé lors de l’assemblage fibrillaire. Nous avons découvert que chondrocalcin clivée fournit aux chondrocytes des signaux impliquant sa ré-internalisation cellulaire, régulant l’expression des gènes de la matrice extracellulaires et des métalloprotéases (Bantsimba-Malanda et al., Matrix Biol. 2013).

De plus, son influence métabolique est déterminée entre autres par son intégration physique à la matrice extracellulaire environnantes, comme pour d’autres molécules matricielles, notamment Matrilin-3 (Vincourt et al. 2012, Matrix Biol). Ces études impliquent le développement d’outils spécifiques, telles que l’analyse quantitative relative des protéines sécrétées par les chondrocytes par spectrométrie de masse sans marquage (Riffault et al. 2015, Proteomic).